Comparação entre os vetores de DNA minicircular e plasmídeo parental na entrega do gene p53 a células cancerígenas do colo do útero infetadas com HPV-18

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Comparação entre os vetores de DNA minicircular e plasmídeo parental na entrega do gene p53 a células cancerígenas do colo do útero infetadas com HPV-18

Terça, 09.02.2021

A equipa liderada por Ângela Sousa, do Centro de Investigação em Ciências da Saúde da Universidade da Beira Interior (CICS-UBI), tem-se focado no desenvolvimento de estratégias biotecnológicas com potencial terapêutico para o tratamento do cancro do colo do útero. O cancro do colo do útero é o quarto cancro mais frequentemente diagnosticado em mulheres, com uma estimativa de 570.000 novos casos e representando 6,6% dos casos totais de cancros femininos em todo o mundo em 2018. O Vírus do Papiloma Humano (HPV) é considerado o principal responsável pelo desenvolvimento e progressão desta doença, uma vez que a sua oncoproteína E6 tem como alvo a proteína supressora de tumor p53, marcando-a para degradação. Deste modo, quando a atividade da proteína p53 se encontra comprometida, as células perdem a capacidade de controlar a paragem do ciclo celular e a morte celular, levando ao desenvolvimento do tumor.

Neste trabalho, foi realizado um estudo comparativo dos vetores de plasmídeo parental (PP) e DNA minicircular (mcDNA) que codificam o gene p53, para entender qual o vetor que exibe as características mais promissoras para a supressão de células cancerígenas do colo do útero infetadas com HPV-18. Os resultados revelaram que o vetor de mcDNA-p53 apresentou uma maior internalização celular e eficiência de transfecção quando comparado com o vetor PP-p53. Em relação à transcrição do gene terapêutico, os níveis de transcritos de p53 foram superiores em células transfectadas com o vetor mcDNA-p53. Relativamente aos níveis de proteína p53, tanto a análise de western blot como o ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) revelaram que a expressão de proteína p53 foi significativamente maior quando o vetor mcDNA-p53 foi utilizado. Em relação à viabilidade celular, também o vetor mcDNA-p53 demonstrou ser eficaz na redução da viabilidade de células cancerígenas e pode ser considerado uma abordagem segura para células não malignas. Adicionalmente, também foi realizado um ensaio de proliferação, sendo possível inferir que o mcDNA-p53 foi mais eficiente em promover a supressão do crescimento de células cancerígenas quando comparado com o seu precursor PP-p53. Considerando também a importância de promover uma morte celular controlada, a indução da apoptose foi investigada e os resultados revelaram que o vetor mcDNA-p53 apresentou um efeito mais pronunciado. Assim, este trabalho demonstrou o enorme potencial do vetor de mcDNA em ser utilizado como um biofármaco inovador em abordagens de terapia génica.

 

Autores e afiliações:

Dalinda Eusébio, Ana Margarida Almeida, Joel Marques Alves, Cláudio Jorge Maia, João António Queiroz, Fani Sousa e Ângela Sousa

CICS-UBI - Centro de Investigação em Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior, Avenida Infante D. Henrique, 6200-506 Covilhã, Portugal

 

Abstract:

Minicircle DNA (mcDNA) has been suggested as a vanguard technology for gene therapy, consisting of a nonviral DNA vector devoid of prokaryotic sequences. Unlike conventional plasmid DNA (pDNA), this small vector is able to sustain high expression rates throughout time. Thus, this work describes the construction, production, and purification of mcDNA-p53 and its precursor parental plasmid (PP)-p53 for a comparative study of both DNA vectors in the growth suppression of human papillomavirus (HPV)-18-infected cervical cancer cells. First, live cell imaging and fluorescence microscopy studies allowed to understand that mcDNA-p53 vector was able to enter cell nuclei more rapidly than PP-p53 vector, leading to a transfection efficiency of 68% against 34%, respectively. Then, p53 transcripts and protein expression assessment revealed that both vectors were able to induce transcription and the target protein expression. However, the mcDNA-p53 vector performance stood out, by demonstrating higher p53 expression levels (91.65 ± 2.82 U/mL vs. 74.75 ± 4.44 U/mL). After assuring the safety of both vectors by viability studies, such potential was confirmed by proliferation and apoptosis assays. These studies confirmed the mcDNA-p53 vector function toward cell cycle arrest and apoptosis in HPV-18-infected cervical cancer cells. Altogether, these results suggest that the mcDNA vector has a more promising and efficient role as a DNA vector than conventional pDNA, opening new investigation lines for cervical cancer treatment in the future.

 

Revista: Nucleic Acid Therapeutics

 

Link: https://www.liebertpub.com/doi/10.1089/nat.2020.0904